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용혈과 혈소판은 cfRNA·miRNA 데이터를 어떻게 망칠까요?

11분 읽기

📌 이 글에서 알 수 있는 것

  • 혈구 RNA가 혈장 cfRNA·miRNA 데이터를 왜곡하는 경로
  • 용혈 QC 방법(육안, A414, miR-451a/miR-23a ΔCq)의 민감도와 컷오프
  • 혈소판 오염과 냉동·해동, 그리고 cfRNA-seq 채혈관 선택의 핵심

🩸 혈장 RNA의 ‘배경 소음’은 혈구에서 옵니다

혈장 cfRNA는 조직의 ‘지금 상태’를 읽을 수 있다는 점에서 주목받습니다(cfRNA 액체생검 글). 문제는 혈액 1 mL 안에 수십억 개의 적혈구와 수억 개의 혈소판이 있고, 이들이 RNA를 대량으로 갖고 있다는 점입니다.

Kirschner 등이 혈액을 분획해 copy 수를 세어 보니, 전혈 1 mL의 miR-16 약 1.15×10¹²개 중 1.09×10¹²개가 적혈구에 있었고 PBMC와 혈장은 합쳐 1%에도 못 미쳤습니다1. 적혈구가 아주 조금만 깨져도 혈장 신호가 크게 흔들리는 이유입니다.

오염원은 세 갈래입니다.

  • 적혈구: miR-451a, miR-16, miR-486-5p, miR-92a. 원인은 용혈입니다2.
  • 혈소판: miR-21, miR-27b, miR-425, miR-126 등 많은 miRNA와 mRNA. 원심분리가 부족하거나 냉동·해동 때 늘어납니다3.
  • 백혈구: miR-223, miR-197(골수계), miR-150(림프계). 혈장 농도가 백혈구 수와 밀접히 상관했습니다2.
혈장 RNA 오염원과 QC 관문 개념도: 적혈구(miR-451a, miR-16, miR-486-5p, miR-92a), 혈소판(miR-21, miR-27b, miR-425, miR-126), 백혈구(miR-223, miR-150)가 혈장 RNA에 섞인다. 관문 1은 A414 흡광도(혈장 0.2 초과면 용혈), 관문 2는 ΔCq(miR-23a 빼기 miR-451a)로 5 초과면 용혈 가능·7~8 이상 고위험, 관문 3은 냉동 전 두 번 원심분리와 혈소판 확인이다.
그림 1. 혈장 RNA의 혈구 오염원과 분석 전 QC 관문. 컷오프 출처는 본문 각주에 있으며, 플랫폼과 시료(혈장/혈청)에 따라 다릅니다.

🔴 용혈: 눈에 보이기 전부터 데이터가 변합니다

Kirschner 등은 비용혈 혈장에 용해 적혈구를 단계적으로 섞었습니다. 혈장이 눈에 띄게 분홍색이 된 것은 적혈구 0.125%(v/v)부터였지만, 산화헤모글로빈 흡수 피크인 414 nm 흡광도(A414)는 0.016%부터 올랐고, miR-16은 육안으로 정상인 0.031%에서 이미 비용혈 25검체 평균을 넘었습니다1. 같은 채혈의 용혈·비용혈 튜브 쌍에서는 miR-16·miR-451이 최대 8배 높았고, Pritchard 등의 용혈 검체에서는 적혈구 miRNA가 20~30배였습니다12.

방법검출 하한(용혈 비율)제시된 기준근거
육안혈장 약 0.125%분홍색Kirschner 2011
A414혈장 0.016%, 혈청 0.004%혈장 >0.2 / 혈청 0.072(저)·0.3(고)Kirschner 2011, Shah 2016
ΔCq(miR-23a − miR-451a)혈청 약 0.001%>5 가능, 7~8 이상 고위험Blondal 2013, Shah 2016
혈액분석기 Hb1% 미만 검출 못 함–Shah 2016

Kirschner의 A414 >0.2 기준은 스파이크 실험에서 정한 값이고, 이를 혈장 45검체(건강인 9, 중피종 20, 관상동맥질환 16)에 적용하자 miR-451(p=0.008)·miR-16(p=0.026)의 개인 간 변동이 줄었습니다1. Shah 등은 혈청에서 ROC로 0.072와 0.3을 제시했고, 측정에는 NanoDrop 1000을 썼습니다4. 컷오프가 연구마다 다르므로, 기준값을 그대로 가져오기보다 자기 장비와 시료 종류로 확인하는 편이 안전합니다.

🧮 RNA만 남았다면: miR-451a/miR-23a ΔCq

원래 혈장이 없고 RNA나 Cq 데이터만 남았다면 miRNA 비율을 씁니다. Blondal 등(당시 Exiqon 소속)은 용혈 영향이 적은 miR-23a를 기준으로 ΔCq = Cq(miR-23a) − Cq(miR-451a)가 5를 넘으면 적혈구 miRNA 오염 가능, 7~8 이상이면 용혈 고위험으로 제시했습니다5. 흔히 보이는 “>7” 기준은 이 범위를 단순화한 것입니다.

민감도는 높습니다. Shah 등의 암 환자·건강인 혈청 86검체에서 이 비율로 용혈이 의심된 시료는 31개(36%)였지만, 육안으로 분홍색이었던 것은 8개(9%)였습니다4.

정규화 함정도 있습니다. miR-16은 한때 흔한 reference miRNA였지만 용혈에 크게 오릅니다. Kirschner 등이 miR-16으로 2^-ΔΔCq를 계산하자, 같은 사람의 용혈 혈장에서 miR-92a·miR-155가 오히려 ‘낮은’ 것처럼 나왔습니다1. 다만 Kirschner 등은 용혈이 없는 시료라면 miR-16·miR-451도 쓸 수 있다고 결론지었습니다1. 용혈 QC를 하지 않을 거라면 적혈구 miRNA를 reference로 쓰지 않는 편이 안전합니다. 외부 spike-in(예: cel-miR-39)은 추출·RT 효율을 확인하는 도구이고, 내인성 reference를 대신하지는 못합니다.

🟣 혈소판: 원심분리와 냉동이 만드는 수천 배

Cheng 등은 건강인 3명의 혈장을 원심분리와 0.22 µm 여과로 단계 처리했습니다. 검출된 miRNA의 72%가 처리 방식만으로 크게 변했고, 10%는 4~30배, 46%는 30~1,000배, 15%는 1,000배 넘게 달라졌습니다. 주된 원인은 혈소판이었고, 두 번째 원심분리로 혈소판의 80~90%, 여과로 99~100%가 제거됐습니다6.

같은 논문의 폐암 12명·대조군 24명 비교에서 환자군 혈장 혈소판이 2.4배 많았는데, 두 군의 원심분리 프로토콜이 달랐습니다6. 환자에서 miRNA가 전반적으로 높아 보인 것이 병 때문인지 처리 때문인지 구분하기 어려운 구조입니다.

냉동·해동도 변수입니다. Mitchell 등은 건강인 6명의 표준 혈장을 한 번 얼렸다 녹이자 CD41+ 혈소판 유래 입자가 약 20배로 늘고 miR-21·miR-27b·miR-425가 크게 올랐다고 보고했습니다. 적혈구 miR-451은 유의한 변화가 없었습니다3. 보관 혈장에서는 해동 후 재원심(1,900×g 10분)을 했는데도, 41검체에서 miR-425 등 혈소판 민감 miRNA가 채혈 당시 혈액검사(CBC)의 혈소판 수와 상관했습니다(R=0.51)3.

결과가 엇갈리는 부분도 있습니다. Cheng 등은 최대 6년 보관한 냉동 혈장도 해동 후 재원심으로 혈소판을 크게 줄일 수 있다고 했고6, Mitchell 등은 해동 후 제거는 부분적이라 냉동 전에 혈소판을 없애야 한다고 결론지었습니다3. 실무적으로는 냉동 전에 두 번 원심분리해 혈소판을 줄이는 것이 두 결과 모두와 맞는 선택입니다. g값·시간과 브레이크·온도 관련 근거는 2편 혈장 vs 혈청에서 다룹니다. 다만 2편의 g값은 cfDNA 수율 기준입니다. miRNA에서는 1,900×g 같은 조건에서도 혈소판이 남을 수 있으므로36, 같은 조건을 쓰더라도 잔여 혈소판 수를 확인하는 편이 안전합니다.

⚪ 백혈구, 그리고 ‘가짜 바이오마커’

Pritchard 등은 문헌에 보고된 고형암 순환 miRNA 바이오마커 79개 중 46개(58%)가 혈구에서 많이 발현된다는 것을 확인했습니다. 혈구 수 변화와 용혈만으로 혈장 miRNA가 최대 50배 달라질 수 있었습니다2. 암 환자는 빈혈, 염증으로 인한 백혈구 증가, 혈소판 증가를 흔히 동반합니다. 그래서 환자군에서 miR-223이 높다면 종양 신호인지 백혈구 수 차이인지 먼저 따져야 합니다.

채혈 후 처리가 늦어지거나 원심분리 뒤 혈장을 피펫으로 걷을 때 백혈구층(buffy coat)에 가까이 가면 이런 오염이 커집니다. 혈장은 경계면에서 충분히 떨어진 위쪽에서만 걷는 것이 기본입니다.

🧬 cfRNA-seq에서는 채혈관도 변수입니다

miRNA RT-qPCR뿐 아니라 전장 cfRNA-seq도 같은 문제를 겪습니다. exRNAQC 컨소시엄은 채혈관 10종, 처리 지연 3구간, RNA 정제법 8종을 조합해 456개 전사체를 만들었습니다. cfDNA용 등 보존(preservation) 튜브는 RNA를 안정화하지 못했고, 모든 보존 튜브 종류에서 최소 1명의 혈장이 용혈됐습니다. 연구진은 cfRNA-seq용으로 citrate 튜브와 채혈 후 4시간 내 처리를 권고했습니다. 다만 채혈관 비교는 건강인 3명에서 이뤄졌습니다7. cfRNA 글의 “6시간"은 혈청 RNA 수치를 본 다른 연구의 권고여서, 시료와 지표가 다릅니다. cfDNA에 맞춘 튜브 선택은 1편 cfDNA 채혈관을 참고하되, cfRNA에는 그 결론을 그대로 옮기지 않는 것이 좋습니다.

암 cfRNA 검출법 RARE-seq 연구도 혈소판 RNA가 결과를 크게 교란해 별도로 보정해야 했다고 보고했습니다8. 혈액 속 다른 분석 대상과의 차이는 액체생검 기초 글에 정리했습니다.

⚠️ 한계와 주의

  • 표본이 작습니다. Cheng의 단계 처리 실험은 3명, Mitchell의 냉동·해동 실험은 6명이었습니다. 방향은 일관되지만 크기(배수)는 일반화하기 어렵습니다.
  • 컷오프는 이식되지 않습니다. A414 기준(0.2 vs 0.072·0.3)과 ΔCq 기준은 혈장/혈청, 분광광도계, RT-qPCR 플랫폼에 따라 달라집니다. ΔCq 기준은 시약 회사 저자들이 자사 플랫폼 경험으로 제시한 값입니다5.
  • miR-451a 자체가 생물학적 신호일 수 있습니다. 빈혈이나 적혈구 생성 변화가 있는 질환에서는 ΔCq가 용혈 외 이유로 움직일 수 있습니다.
  • QC로 걸러도 군 간 처리 차이는 남습니다. 환자군과 대조군을 다른 시기·기관·프로토콜로 모으면 QC를 통과해도 편향이 남습니다.

🏛️ 지금 어디까지 왔나

  • 국제 표준: ISO 20186-1:2019는 정맥 전혈의 세포 RNA 검사 전 과정을 다루며, 혈장 무세포 RNA는 범위 밖이라고 명시합니다9. 혈장 순환 무세포 RNA(ccfRNA)는 유럽표준화위원회의 기술 시방서 CEN/TS 17742:2022가 채혈·취급·보관·처리·기록 요구사항을 다룹니다10. 이 시방서를 바탕으로 한 ISO 국제표준(ISO 18703)이 개발 중인 것으로 보이며, 검토일(2026-11-03) 기준 발행되지 않았습니다.
  • 연구 커뮤니티: 용혈(A414 또는 ΔCq)과 혈소판 관리는 혈장 miRNA 연구의 사실상 기본 QC가 됐지만, 하나로 합의된 컷오프는 없습니다.
  • 한국: 혈장 cfRNA 검사 전 과정에 대한 KS 부합화 여부나 식약처 가이드라인은 확인하지 못했습니다.

🧪 연구자 노트 (작성자 직접 작성) ① 육안으로 분홍빛이 보이는 시료는 바로 표시해 두고, 추출 전에 A414를 재고 추출 후에는 miR-23a와 miR-451a의 ΔCq를 함께 봅니다. 제외 기준은 연구를 시작하기 전에 하나로 정하고, 환자군과 대조군의 값 분포가 비슷한지도 확인합니다. ② 재현이 안 됐던 경우를 돌아보면 질병 신호보다 시료 처리 차이인 경우가 많았습니다. 예를 들어 두 군의 시료가 다른 시기·기관에서 모였거나, 원심 횟수나 해동 이력이 달랐습니다. ③ 새 miRNA 바이오마커 논문을 보면 먼저 후보 miRNA가 적혈구·혈소판·백혈구에 많은 종류인지 확인합니다. 그다음 용혈 QC를 했는지, 두 군의 처리 조건이 같았는지, 독립 코호트에서 다시 확인했는지를 봅니다.

🙋 그래서 나에게는? — 실험 전 체크리스트

  • 채혈관 종류, 채혈~원심분리 시간, 원심분리 조건을 환자군과 대조군에서 똑같이 정했다.
  • 냉동 전에 두 번 원심분리해 혈소판을 줄이고, 혈장은 백혈구층에서 떨어진 위쪽만 걷는다.
  • 추출 전 A414(측정 장비도 함께)를, 추출 후 ΔCq(miR-23a − miR-451a)를 기록하고 제외 기준을 미리 정했다.
  • 용혈 QC 없이 miR-16·miR-451a처럼 혈구에 많은 miRNA를 reference로 쓰지 않고, spike-in으로 추출·RT 효율을 따로 확인한다.
  • 후보 miRNA가 적혈구·혈소판·백혈구에서 많이 발현되는지 확인하고, 가능하면 혈구 수(CBC)를 함께 기록한다.
  • 보관 시료는 처리 이력(냉동 전 원심 횟수, 해동 횟수)을 메타데이터에 남긴다.

⚠️ 이 글은 의학적 조언이 아니며, 특정 제품을 권하지 않습니다. 실제 조건은 사용하는 채혈관·키트 설명서와 기관 SOP, 자체 검증 결과를 우선하세요.

❓ 자주 묻는 질문

Q. 혈장이 분홍색이 아니면 용혈이 없는 건가요? A. 아닙니다. 혈장 실험에서 육안 변화는 적혈구 약 0.125%부터 보였지만 miRNA는 0.031%에서 이미 올랐습니다1. A414나 ΔCq로 확인하는 것이 안전합니다.

Q. ΔCq 기준은 7로 쓰면 되나요? A. 원 논문은 5 초과를 ‘가능’, 7~8 이상을 ‘고위험’으로 제시했습니다5. 연구 전체에서 하나의 기준을 미리 정하고, 군 간 ΔCq 분포가 비슷한지도 함께 보세요.

Q. 이미 한 번 원심분리해 얼려 둔 혈장은 못 쓰나요? A. 해동 후 재원심으로 혈소판이 크게 줄었다는 보고와 효과가 부분적이라는 보고가 엇갈립니다63. 쓸 경우 군 간 처리 이력을 맞추고 혈소판 민감 miRNA는 해석을 보수적으로 하세요.

📚 오믹스 데이터 랩 시리즈

참고

  1. Kirschner MB 외. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One 2011;6:e24145. doi:10.1371/journal.pone.0024145 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  2. Pritchard CC 외. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila) 2012;5:492-7. doi:10.1158/1940-6207.CAPR-11-0370 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  3. Mitchell AJ 외. Platelets confound the measurement of extracellular miRNA in archived plasma. Sci Rep 2016;6:32651. doi:10.1038/srep32651 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  4. Shah JS 외. Comparison of methodologies to detect low levels of hemolysis in serum for accurate assessment of serum microRNAs. PLoS One 2016;11:e0153200. doi:10.1371/journal.pone.0153200 ↩︎ ↩︎

  5. Blondal T 외. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids. Methods 2013;59:S1-6. doi:10.1016/j.ymeth.2012.09.015 ↩︎ ↩︎ ↩︎

  6. Cheng HH 외. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One 2013;8:e64795. doi:10.1371/journal.pone.0064795 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  7. exRNAQC Consortium. Blood collection tube and RNA purification method recommendations for extracellular RNA transcriptome profiling. Nat Commun 2025;16:4513. doi:10.1038/s41467-025-58607-7 ↩︎

  8. Nesselbush MC 외. An ultrasensitive method for detection of cell-free RNA. Nature 2025;641:759-68. doi:10.1038/s41586-025-08834-1 ↩︎

  9. ISO 20186-1:2019. Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for venous whole blood — Part 1: Isolated cellular RNA. ISO ↩︎

  10. CEN/TS 17742:2022. Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for venous whole blood — Isolated circulating cell free RNA from plasma. iTeh 표준 목록 ↩︎

#cfRNA#액체생검#전사체#용혈#혈소판오염

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