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혈장이냐 혈청이냐, cfDNA 시료는 왜 원심분리를 두 번 할까?

12분 읽기

📌 이 글에서 알 수 있는 것

  • 혈청 cfDNA가 혈장보다 높게 나오는 이유와 연구별 숫자
  • 2단계 원심분리 조건: 지침과 연구가 제시한 범위
  • 브레이크·온도·옮겨 담기, 혈소판(PPP·PFP)에서 실제로 차이가 나는 지점
  • TapeStation·Bioanalyzer로 gDNA 오염을 확인하는 법
  • 단백체·대사체에서 혈장과 혈청이 다른 정도

🩸 혈장과 혈청, 출발점이 다릅니다

혈장(plasma)은 EDTA 같은 항응고제 튜브에서 혈구를 가라앉히고 남은 액체이고, 혈청(serum)은 항응고제 없이 피를 굳힌 뒤 응고 덩어리를 빼고 남은 액체입니다. cfDNA(세포유리 DNA)의 개념은 진단 기초 시리즈 1편에 정리돼 있습니다. cfDNA에서 이 차이가 중요한 이유는 응고가 진행되는 동안 백혈구가 깨지기 때문입니다.

미국 혈액원 연구진은 신선 혈청의 cfDNA가 신선 혈장보다 약 20배 높았고, 응고 튜브를 4 °C에 4~5일 두자 기준의 100배 이상으로 늘었다고 보고했습니다. 항응고제 없는 여성 혈액에 남성 백혈구를 넣자 응고 중에 깨져 남성 DNA가 혈청으로 나왔습니다. 저자들은 혈청 cfDNA 대부분이 채혈관 안에서 생긴다고 결론 내렸습니다1.

홍콩중문대 연구진은 임신 3분기 13명의 EDTA 혈장과 혈청을 비교했습니다. 혈청에서는 태아 DNA 분율이 모두 낮았고, 조각 길이 분포가 긴 쪽으로 이동했으며, 메틸화로 조직 기원을 추정하면 호중구·B세포 유래 DNA가 늘었습니다. 혈청관 종류에 따라 cfDNA 농도도 달랐습니다2.

다른 해석도 있습니다. 종양 환자 24쌍을 정제 없이 ALU-qPCR로 잰 연구에서 혈청은 평균 970 pg/µL, 혈장은 180 pg/µL였고, 분리 중 혈구 파괴로 설명되는 몫(약 8.2%)을 빼도 혈청이 약 6배 높아 저자들은 혈청을 더 나은 시료로 보았습니다3. 다만 ctDNA처럼 비율(VAF)이 중요한 분석에서는 배경 gDNA가 늘면 종양 신호가 희석되므로, 지금의 지침은 EDTA 혈장을 기준으로 합니다4.

튜브 종류와 첫 원심 전까지의 시간·온도는 오믹스 데이터 랩 1편에서 다룹니다. 이 글은 원심분리부터 시작합니다.

🌀 왜 두 번 돌리나: 2단계 원심분리

1차 저속 원심은 적혈구와 백혈구를 가라앉혀 혈장 / 백혈구층(buffy coat, 백혈구·혈소판) / 적혈구 세 층을 만듭니다. 그런데 이렇게 얻은 혈장에도 혈소판과 일부 세포가 남아 있고, 이 세포가 나중에(특히 냉동·해동 때) 깨지면 gDNA가 더해집니다. 그래서 위쪽 혈장만 새 튜브로 옮겨 한 번 더 돌려 남은 세포를 제거합니다. 2001년 홍콩중문대 연구는 처리법에 따라 임신부 혈장의 총 DNA 정량값이 유의하게 달라지고(P<0.001), 원심 뒤 미세원심이나 필터를 더하면 세포 없는 혈장을 얻는 데 효과적이라고 보고했습니다5.

혈장 2단계 원심분리 개념도: 1차 저속 원심으로 혈장, buffy coat, 적혈구 층이 생기고, 위쪽 혈장만 옮겨 2차 고속 원심으로 남은 혈소판과 세포를 가라앉힌다. 혈청은 응고 중 백혈구가 깨져 gDNA가 더해지고, 크기 분포에서 약 166 bp 주 피크 외 고분자량 피크가 보이면 gDNA 오염을 의심한다.
그림 1. 혈장 2단계 원심분리와 혈청의 차이. g값은 아래 표의 문헌·지침 범위이며, 크기 분포 곡선은 개념적 표현입니다.
출처1차2차대상·결과
NCI 근거 기반 지침 (2020)800~1,600×g, 20분14,000~16,000×g, 10~20분전문가 8명 권고, 문헌 70여 편 검토. 문헌에서는 1차 400~16,000×g, 2차 3,000~14,000×g까지 다양한 조합이 쓰였음4
Risberg 외 (2018)820 또는 1,600×g, 10분14,000 또는 3,000×g, 10분암 환자 13명, 세 조합 간 cfDNA 수율·변이 분율 유의차 없음6
Page 외 (2013)1,000×g, 10분, 4 °C1,000 / 2,000 / 10,000×g, 10분cfDNA 수율 비슷(수치 비공개)7
Sherwood 외 (2016)2,000×g, 10분2,000×g, 10분폐암 5명. 72시간 둔 EDTA 혈액에서 1회 35.5 vs 2회 19.4 ng/µL(5명 중 4명 감소, p=0.058)8
Cavallone 외 (2019)—해동 혈장 3,000×g신선 혈장 16,000×g와 효율 비슷9

정리하면 2차를 고속으로 하느냐 3,000×g로 하느냐는 cfDNA 수율에 큰 차이를 보이지 않았지만, 비교 연구 대부분이 수십 명 이하였습니다. 2시간 안에 처리한 혈액에서는 1회와 2회 원심의 차이도 작았고, 차이는 혈액이 오래 놓여 백혈구가 약해졌을 때 커졌습니다8. 다만 이는 핵 cfDNA 수율 기준입니다. 같은 혈장을 cfRNA·단백체·미토콘드리아 DNA에도 쓸 계획이라면 혈소판을 얼마나 제거했는지가 더 중요해집니다(3편)10.

🧊 옮겨 담기·브레이크·온도

  • 옮겨 담기가 가장 큰 변수입니다. buffy coat 바로 위까지 빨아들이면 2차 원심으로도 다 걸러지지 않을 수 있습니다. 단백체 연구에서는 혈소판층 위 마지막 약 500 µL를 남기라고 권하고, 원심 후 회수가 늦어지는 것만으로도 혈소판 단백 오염이 생길 수 있다고 지적했습니다11. cfDNA 연구에서도 1,600×g 10분(실온, swing-out 로터) 뒤 혈장 약 500 µL를 남기고 옮긴 사례가 있습니다12.
  • 브레이크·가속: 층이 흔들리지 않게 브레이크를 약하게 거는 SOP가 많지만, cfDNA에서 브레이크 설정을 직접 비교한 연구는 찾지 못했습니다. 위 연구들도 대부분 브레이크를 적지 않았습니다6.
  • 온도: 연구마다 4 °C(Page 외)와 실온이 섞여 쓰이고, NCI 지침도 원심 온도를 따로 정하지 않았습니다4. 원심 온도만 바꾼 비교는 소규모뿐이라, 정한 온도를 연구 내내 일정하게 유지하고 기록하는 것이 현실적입니다.

🧫 혈소판: PPP와 PFP, 단백체·대사체에서는

PPP(platelet-poor plasma)는 혈소판을 줄인 혈장, PFP(platelet-free plasma)는 거의 없앤 혈장을 뜻하지만 경계 수치는 분야마다 다릅니다(응고검사에서는 혈소판 <10×10⁹/L를 PPP로 보는 관례가 있습니다). 혈소판에는 핵이 없지만 미토콘드리아 DNA가 있어 미토콘드리아 cfDNA를 정량하려면 냉동 전 고속 원심이 필요하다는 보고가 있습니다10.

단백체에서는 차이가 더 큽니다.

  • HUPO 혈장 프로테옴 프로젝트(35개 실험실)는 혈청 대신 EDTA(또는 citrate) 혈장을 권고했습니다13.
  • 독일 막스플랑크 연구진의 질량분석에서 같은 4명의 혈청·혈장(각 72시료)을 비교하니 2,099개 단백질 중 299개가 달랐고, 피브리노겐 사슬은 혈청에서 40배 넘게 줄었습니다. 문헌 210편 중 113편(54%)이 혈소판·적혈구 오염이나 응고와 관련된 ‘품질 마커’ 단백질을 바이오마커 후보로 보고했습니다11.
  • 대장내시경 예정자 125명에서 2회 원심은 1회보다 vWF(비 0.86)·CD44(0.85)는 낮게, IL6ST(1.18)는 높게 측정됐습니다14.

대사체에서는 공복 377명의 동시 채취 시료에서 분석한 122개 대사물질 중 104개가 혈청에서 더 높았지만 혈장·혈청 값의 상관은 평균 r=0.81로 비례적이었습니다. 저자들은 같은 매트릭스를 일관되게 쓰면 비슷한 결론을 얻을 수 있다고 봤습니다15. 단백체 측정 기술 자체는 진단 기초 시리즈 21편, 혈소판이 RNA에 주는 영향은 오믹스 데이터 랩 3편을 참고하세요.

📏 잘 됐는지 확인하기: 크기 분포

cfDNA는 뉴클레오솜 단위로 잘려 약 166 bp에 주 피크가 있고, 그 두 배 근처에 작은 피크가 보입니다(진단 기초 시리즈 17편). 세포가 깨져 들어온 gDNA는 길어서 수 kb 이상의 고분자량(HMW) 피크로 나타납니다.

  • TapeStation·Bioanalyzer: 제조사 자료에 따르면 cfDNA 전용 분석은 50~700 bp 구간을 cfDNA로 보고 전체 중 비율(%cfDNA)을 계산하며, 오른쪽 HMW 피크를 함께 보여 줍니다. 보편적인 합격 기준은 제시하지 않으므로 실험실이 자체 기준을 정해야 합니다.
  • 짧은·긴 앰플리콘 qPCR/ddPCR: 미국 TGen 연구진은 짧은 앰플리콘 5개와 긴 앰플리콘 4개로 조각 길이를 보는 ddPCR을 만들었고, 임상 시료 219건에서 채혈 직후 처리한 혈장의 조각이 보관 시료보다 짧았습니다16.
  • 정량만 보지 마세요. 농도가 높게 나왔다면 질병 신호보다 gDNA 오염을 먼저 의심해야 합니다. NCI 지침도 정제 cfDNA가 gDNA 오염과 PCR 저해물질 없이 분석에 적합한지 평가하라고 권고합니다4.

⚠️ 한계와 주의

  • 비교 연구가 작습니다. 원심 조건 비교는 대부분 5~13명 규모였고, 수율이나 qPCR 위주라 프래그먼토믹스·메틸화 같은 정밀 분석에서도 같은 결론인지는 따로 확인해야 합니다.
  • 조건은 묶음으로 작동합니다. 튜브 종류, 처리까지의 시간, 원심, 보관이 서로 영향을 주므로 원심 조건 하나만 바꿔 다른 연구의 숫자와 비교하기 어렵습니다.
  • 혈청 연구를 버릴 필요는 없습니다. 혈청도 질병 집단 간 차이를 보여 왔지만, 혈장 기준값이나 VAF와 그대로 비교하면 안 됩니다.

🏛️ 지금 어디까지 왔나

  • 국제 표준: ISO 20186-3:2019는 정맥 전혈 채혈관 시료에서 혈장 ccfDNA의 검사 전 단계(취급·보관·처리·문서화) 요구사항을 정합니다. 의료 검사실뿐 아니라 IVD 제조사·바이오뱅크·연구기관도 대상이며, 2024년 검토에서 현행 유지가 확인됐고, 이후 개정 작업이 제안된 것으로 보입니다17. 유럽의 이전 기술 사양 CEN/TS 16835-3:2015는 이 표준으로 대체됐습니다. 세부 조건은 유료 본문이라 이 글에 옮기지 않았습니다.
  • 근거 기반 지침: 미국 NCI는 2단계 원심과 범위를 제시하되, 실험실이 최적안과 허용 가능한 대안 중에서 고르도록 했습니다. 원심 외에도 혈장은 −80 °C 이하에 보관하고 동결·해동은 1회 이하로 하도록 권했습니다4.
  • 한국: 해외 표준 데이터베이스에 따르면 ISO 20186-3을 도입한 KS P ISO 20186-3이 2023년 12월 발행된 것으로 나오지만, 국내 원문은 확인하지 못했습니다. 연구용 cfDNA 원심 조건을 정한 국내 학회·식약처 지침도 확인하지 못했습니다.

🧪 연구자 노트 (작성자 직접 작성) ① 저희는 사용하는 보존 채혈관 제조사가 성능 자료를 만들 때 쓴 조건을 그대로 따릅니다. 1차는 10 °C에서 1,600×g 10분이고, 백혈구층이 흔들리지 않게 조심해서 꺼냅니다. 혈장은 최대 5 mL만 새 15 mL 튜브로 옮기고, 2차는 10 °C에서 약 3,200×g 10분 돌립니다. 채혈관 자체가 견딜 수 있는 원심 속도에 상한이 있어서, 16,000×g 같은 고속 조건보다 제조사가 검증한 조건을 택했습니다. ② 혈청밖에 없다면 그 시료로 억지로 맞추기보다, 혈장으로 연구할 수 있게 연구 설계를 새로 하기를 권합니다. 혈장과 혈청은 결과가 많이 달라서, 혈청 결과를 혈장 연구와 이어 붙이기 어렵기 때문입니다. ③ 가장 중요한 것은 백혈구층에 닿지 않게 여유를 두고 피펫팅하는 것입니다. 그러려면 채혈 단계에서 튜브에 혈액을 충분히 채워야 합니다. 혈액량이 적으면 여유를 두고 옮길 수 있는 혈장이 줄어 백혈구층 가까이 가게 됩니다.

🙋 그래서 나에게는? — 실험 전 체크리스트

  • 분석물에 맞는 매트릭스(cfDNA·단백체는 EDTA 혈장)를 정하고, 연구 전체에서 하나로 통일했나요?
  • 1차·2차 원심의 ×g(rpm 아님)·시간·온도·브레이크를 SOP에 적었나요?
  • 옮길 때 buffy coat 위로 여유를 남기도록 정했나요?
  • 고속 원심기가 없을 때의 대안(예: 3,000×g 2차)을 미리 검증했나요? (cfDNA 외에 cfRNA·단백체도 볼 혈장이라면 잔여 혈소판도 함께 확인)
  • 일부 시료로 크기 분포를 보고 HMW 피크 기준을 정했나요?
  • 원심 조건과 처리 시각을 시료마다 기록하고, 바로 쓰지 않을 혈장은 소분해 두었나요?

⚠️ 이 글은 의학적 조언이 아니며, 특정 제품을 권하지 않습니다. 실제 조건은 사용하는 채혈관·키트 설명서와 기관 SOP, 자체 검증 결과를 우선하세요.

❓ 자주 묻는 질문

Q. 이미 모아 둔 혈청으로 cfDNA 분석을 해도 되나요? A. 가능은 하지만 백혈구 유래 gDNA가 섞여 농도는 높고 VAF는 낮게 나올 수 있습니다. 혈청끼리만 비교하고, 크기 분포로 오염 정도를 먼저 확인하세요.

Q. 2차 원심은 꼭 16,000×g이어야 하나요? A. 몇몇 연구에서 3,000×g도 cfDNA 수율이 비슷했습니다. 다만 소규모 결과이므로 바꾸려면 자체 비교로 확인하세요.

Q. 냉동 혈장을 녹인 뒤 원심해도 되나요? A. 한 연구에서는 해동 혈장의 3,000×g 원심이 신선 혈장 16,000×g와 비슷했습니다. 그래도 가능하면 냉동 전에 2차 원심을 마치는 것이 원칙이고, NCI 지침은 동결·해동을 1회 이하로 권합니다4.

📚 오믹스 데이터 랩 시리즈

참고

  1. Lee TH 외. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion 2001;41:276-82. doi:10.1046/j.1537-2995.2001.41020276.x ↩︎

  2. Wong FCK 외. Cell-free DNA in maternal plasma and serum: a comparison of quantity, quality and tissue origin using genomic and epigenomic approaches. Clin Biochem 2016;49:1379-86. doi:10.1016/j.clinbiochem.2016.09.009 ↩︎

  3. Umetani N 외. Higher amount of free circulating DNA in serum than in plasma is not mainly caused by contaminated extraneous DNA during separation. Ann N Y Acad Sci 2006;1075:299-307. doi:10.1196/annals.1368.040 ↩︎

  4. Greytak SR 외. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clin Cancer Res 2020;26:3104-9. doi:10.1158/1078-0432.CCR-19-3015 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  5. Chiu RWK 외. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-13. PMID:11514393 ↩︎

  6. Risberg B 외. Effects of collection and processing procedures on plasma circulating cell-free DNA from cancer patients. J Mol Diagn 2018;20:883-92. doi:10.1016/j.jmoldx.2018.07.005 ↩︎ ↩︎

  7. Page K 외. Influence of plasma processing on recovery and analysis of circulating nucleic acids. PLoS One 2013;8:e77963. doi:10.1371/journal.pone.0077963 ↩︎

  8. Sherwood JL 외. Optimised pre-analytical methods improve KRAS mutation detection in circulating tumour DNA (ctDNA) from patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). PLoS One 2016;11:e0150197. doi:10.1371/journal.pone.0150197 ↩︎ ↩︎

  9. Cavallone L 외. A study of pre-analytical variables and optimization of extraction method for circulating tumor DNA measurements by digital droplet PCR. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2019;28:909-16. doi:10.1158/1055-9965.EPI-18-0586 ↩︎

  10. Cox DRA 외. High speed centrifugation before frozen storage of plasma is critical for quantitative analysis of mitochondrial-derived cell-free DNA. Clin Chem 2020;66:1111-4. doi:10.1093/clinchem/hvaa127 ↩︎ ↩︎

  11. Geyer PE 외. Plasma Proteome Profiling to detect and avoid sample-related biases in biomarker studies. EMBO Mol Med 2019;11:e10427. doi:10.15252/emmm.201910427 ↩︎ ↩︎

  12. Medina Diaz I 외. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One 2016;11:e0166354. doi:10.1371/journal.pone.0166354 ↩︎

  13. Omenn GS 외. Overview of the HUPO Plasma Proteome Project: results from the pilot phase with 35 collaborating laboratories and multiple analytical groups. Proteomics 2005;5:3226-45. doi:10.1002/pmic.200500358 ↩︎

  14. Lech Pedersen N 외. Development of blood-based biomarker tests for early detection of colorectal neoplasia: influence of blood collection timing and handling procedures. Clin Chim Acta 2020;507:39-53. doi:10.1016/j.cca.2020.03.035 ↩︎

  15. Yu Z 외. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One 2011;6:e21230. doi:10.1371/journal.pone.0021230 ↩︎

  16. Markus H 외. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Sci Rep 2018;8:7375. doi:10.1038/s41598-018-25810-0 ↩︎

  17. ISO 20186-3:2019. Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for venous whole blood — Part 3: Isolated circulating cell free DNA from plasma (공개 범위, 2024 확인) — iso.org ↩︎

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