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FASTQ에서 VCF까지, WGS 데이터는 어떻게 믿을 수 있게 만들까요?

17분 읽기

📌 이 글에서 알 수 있는 것

  • germline short-read WGS의 FASTQ→BAM→VCF 단계와, 단계별로 결과가 갈리는 지점
  • GRCh38 analysis set과 T2T-CHM13 중 무엇을 고를지
  • GATK·DeepVariant·DRAGEN을 GIAB 벤치마크로 비교하는 법
  • 시료 QC 지표의 통상 범위와 그 출처

🧬 같은 FASTQ, 다른 VCF

WGS 2차 분석(secondary analysis)은 리드(FASTQ)를 참조 유전체에 정렬해 BAM/CRAM을 만들고, 변이를 불러 VCF로 정리하는 과정입니다. 단계마다 선택지가 있어서, 같은 FASTQ에서도 다른 VCF가 나옵니다.

얼마나 다를까요? 미국 CCDG·TOPMed 5개 센터가 14개 유전체를 각자 파이프라인으로 처리하자, 조화 전에는 특히 SV에서 차이가 컸고 상당 부분이 서로 다른 GRCh37 판본 때문이었습니다. 정렬기·참조·중복 표시·품질 점수 형식을 맞춘 뒤에는 파이프라인 간 불일치가 SNV 0.4%, indel 1.8%, SV 1.1%로, 같은 DNA를 다시 시퀀싱한 복제 간 차이(7.1%, 24.0%, 39.9%)보다 한 자릿수 낮아졌습니다1. 이렇게 맞춘 처리 기준이 기능적 동등성(functional equivalence, FE) 표준입니다(2018년 표준 원논문의 수치). 최근 비교에서도 결과를 가른 것은 주로 호출기였습니다. GIAB 14개 WES·WGS 데이터로 정렬기 4종과 호출기 9종을 조합한 2022년 연구에서 정확도는 정렬기보다 호출기에 좌우됐고(Bowtie2 제외), DeepVariant가 가장 좋고 안정적이었습니다2.

germline WGS 2차 분석 흐름도. FASTQ 품질 확인, 참조 유전체(GRCh38 analysis set 또는 T2T-CHM13)에 BWA-MEM 계열로 정렬, 중복 표시, 선택적 BQSR, 변이 호출(GATK HaplotypeCaller, DeepVariant, DRAGEN), 필터링을 거쳐 VCF가 된다. 오른쪽에는 단계별 QC 관문(Q30 비율, 매핑률·중복률·insert size, Ti/Tv·het/hom·오염·성별·친족 확인)이, 아래에는 GIAB HG002로 hap.py 채점을 하는 검증 고리가 있다.
그림 1. germline WGS 2차 분석과 QC 관문. 도구 이름은 예시이며 특정 제품을 권하지 않습니다.

🗺️ 참조 유전체: GRCh38 analysis set? T2T-CHM13?

선택내용주의할 점
GRCh37(hg19)과거 데이터·주석 자원이 많음판본(b37, hg19, hs37d5)이 섞이면 배치 효과
GRCh38 analysis setchrY PAR·중복 centromere 배열을 마스킹, EBV 포함. alt 포함(full) 여부와 decoy(hs38d1) 포함(plus) 여부로 4종3alt를 넣으면 alt-aware 정렬이 필요. 아니면 MAPQ 0 리드가 늘어 변이를 놓침4
T2T-CHM13기존 참조에 없던 8%를 채운 3.055 Gbp 완성 서열5주석·집단 빈도 자원, 임상 보고 체계는 아직 GRCh38 중심

T2T-CHM13은 1000 Genomes 3,202명 short-read 데이터에서 시료당 수만 개의 가짜 SNV를 줄였고, GRCh38에 잘못 중복된 12개 영역(1.2 Mbp, 유전자 74개)을 바로잡았습니다. 269개 의학 관련 유전자의 위양성은 최대 12배 줄었지만, 이 수치는 롱리드(HiFi) 기준입니다6. 다만 새로 들어온 영역 대부분이 반복 서열이라, 같은 벤치마크로 재면 CHM13 쪽에 어려운 영역이 더 많이 잡히고 그만큼 성능 페널티가 생깁니다7. 공개 코호트와 합쳐 분석할 계획이면 GRCh38(FE 표준은 alt를 포함한 1000 Genomes 판 GRCh38DH 사용)을1, 반복·분절 중복 영역 자체가 연구 대상이면 CHM13 병행을 검토할 만합니다.

⚙️ 정렬·중복 표시·BQSR

  • FASTQ QC: FastQC·fastp(2023 개정)8 등으로 염기 품질, 어댑터, GC 분포를 봅니다. FE 표준 파이프라인들은 별도 트리밍 없이 BWA-MEM 정렬로 시작했습니다1.
  • 정렬: short read는 BWA-MEM이 사실상 표준이고, BWA-MEM2는 같은 정렬 결과를 1.3~3.1배 빠르게 냅니다9. 롱리드는 minimap2 같은 다른 정렬기를 씁니다.
  • 중복 표시(duplicate marking): PCR·광학 중복을 표시해 같은 분자를 여러 번 세지 않게 합니다(Picard MarkDuplicates, samblaster 등).
  • BQSR(base quality score recalibration): 시퀀서가 매긴 염기 품질 점수를 알려진 변이 부위 밖의 불일치로 다시 보정합니다. GATK 흐름에서는 표준 단계지만, DeepVariant 문서는 BQSR을 하지 말 것을 권합니다(정확도가 소폭 떨어짐)10. 호출기에 맞춰 넣고 빼야 하는 단계입니다.

🎯 변이 호출: 무엇을 고를까

호출기방식특징
GATK HaplotypeCaller국소 재조립 + 통계 모델. gVCF→joint genotypingVQSR은 사람 기준 전장 유전체 1개 이상 또는 엑솜 30개 이상에서 대체로 작동11, 그보다 작으면 하드 필터(QD·FS·MQ 등 주석 기준). 후속 필터 VETS는 베타
DeepVariant리드 pileup 이미지를 CNN으로 분류12오픈소스, BQSR 불필요10. 코호트는 GLnexus로 병합
DRAGEN하드웨어 가속, 다중 유전체(그래프) 정렬, ML 필터13상용. 원시 리드→변이 약 30분(회사 공동 연구, 전용 하드웨어 기준)

2020년 precisionFDA Truth Challenge V2에서는 20팀이 64개 콜셋을 냈고, 35× PCR-free Illumina 데이터로 반맹검 부모 시료(HG003·HG004)를 채점했습니다. short-read 최상위는 DRAGEN과 Seven Bridges처럼 그래프 참조를 쓴 통계적 방법이었고, Seven Bridges는 MHC에서 F1 0.992를 냈습니다. Illumina 데이터로 낸 DeepVariant 제출은 전체 벤치마크 영역에서 SNV F1 99.57%, indel 99.59%였습니다. 참가자가 HG002 정답을 보고 모델을 조정할 수 있어 과적합 가능성도 분석됐는데, 그 정도는 롱리드·다중 기술 머신러닝 제출에서 컸고, Illumina 제출은 대체로 작았습니다(HG002 대비 부모 시료 오류율 비 중앙값 약 1.06)14. 모두 2020년 시점의 비교입니다.

더 최근의 독립 비교(2026)는 HG002를 T2T-HG002 v1.1 벤치마크와 의학 관련 유전자(CMRG) 벤치마크로 채점했습니다. short-read 파이프라인 7종은 SNV F1 98.5% 이상, indel 91.7% 이상(T2T 기준)이었고, DRAGEN, DeepVariant, Clair3·GATK 순이었습니다15.

SV는 여전히 약합니다. 같은 연구에서 short-read(합성 리드 포함)의 SV 탐지 F1은 결손 평균 55.9%, 삽입 25.9%(T2T 기준)로, 롱리드(85.0%, 80.8%)보다 크게 낮았습니다15. HG002 결손만 본 2025년 비교에서는 short-read 호출기 10종 중 DRAGEN v4.2가 F1 83%, 오픈소스 Manta가 74%였고, minimap2 정렬 + Manta 조합은 81%였습니다(Illumina 25×, GIAB Tier1 결손 기준, 일부 저자 회사 소속)16. 그래서 SV는 2개 이상의 호출을 겹쳐 보거나 롱리드로 확인하는 경우가 많습니다.

📏 GIAB로 파이프라인 채점하기

GIAB(Genome in a Bottle)는 NIST가 특성을 밝힌 표준 시료와 “정답” 변이 목록을 제공합니다. HG001(NA12878)과 Ashkenazi 트리오 HG002~HG004가 대표적입니다. v4.2.1 벤치마크는 HG002 GRCh38 상염색체의 92%를 덮으며(이전 85%), 이전 판보다 short-read 콜셋의 위음성을 8배 더 찾아냈습니다17. HG002는 이후 새 판이 나와 v4.2.1을 대체했습니다(🏛️ 참고).

  • 비교 도구: GA4GH 벤치마킹 방식(hap.py + vcfeval)은 같은 변이를 다르게 표기한 경우까지 맞춰 비교합니다. precision, recall, F1을 SNV·indel별로 냅니다18.
  • 영역을 나눠 보기: 같은 두 방법의 SNV 일치율이 고신뢰 영역 안에서는 99.7%, 밖에서는 76.5%였습니다18. 전체 F1 하나보다 stratification(분절 중복, 호모폴리머, MHC, 낮은 mappability 등) 결과를 함께 보고해야 합니다7.
  • 벤치마크 판 차이: 2016년 1차 챌린지 우승 콜셋을 v4.2로 다시 채점하면 SNV 오류율이 최대 10배 높아졌습니다14. 어느 판으로 채점했는지 밝혀야 숫자를 비교할 수 있습니다.

📊 시료 QC 지표

지표통상 범위·기준의심할 것근거
매핑률임상 감시 지표 >98%(MGI), 체세포 권고 >95%(SEQC2)오염, 종 불일치, 참조 판본 오류Marshall19, Xiao20
중복률임상 감시 지표 <10%(MGI)라이브러리 복잡도 부족Marshall19
중앙 insert size임상 감시 지표 >300 bp(MGI), gnomAD v3.1은 250 bp 미만 제외과도한 DNA 분절Marshall19, gnomAD21
평균 심도임상 ≥30×(MGI), All of Us 출고 기준 ≥30×·게놈 90% 이상 20×, gnomAD v3.1은 chr20 15× 미만 제외(2편)설계 미달Marshall19, All of Us22, gnomAD21
Ti/Tv (WGS)시료당 약 2.0~2.1(관례 값). 조상 보정 후 중앙값에서 4 MAD 벗어나면 이상치낮으면 위양성 SNV 증가gnomAD21
이형접합/비참조 동형접합 비(het/hom)조상에 따라 다름. 조상 보정 후 4 MAD 초과, 또는 3.3 초과면 제외오염(높음), 근친·LOH(낮음)gnomAD21
오염임상 통과 ≤2%(MGI), All of Us 임상 ≤1%·연구 ≤3%, gnomAD v3.1은 5% 초과 제외시료 간 교차 오염VerifyBamID223, Marshall19, All of Us22
키메라 리드gnomAD v3.1은 5% 초과 제외라이브러리 문제gnomAD21
성별정규화한 chrX·chrY 심도, 기록된 성별과 대조기록 오류, 시료 뒤바뀜, 성염색체 이상gnomAD21, All of Us22
친족·동일인기대한 관계와 일치, 별도 어레이 지문과 일치시료 뒤바뀜, 중복 시료somalier24, All of Us22

“통상 범위"는 표준이 아니라 임상 지침의 기준값이나 대규모 프로젝트의 제외 기준입니다. 임상 기준(MGI)과 연구 코호트 제외 기준(gnomAD)은 목적이 다릅니다. gnomAD v3.1(2020)은 SNV 수·Ti/Tv·het/hom 등을 조상 주성분을 회귀로 뺀 뒤 중앙값에서 4 MAD 넘게 벗어난 시료를 걸렀고, v4(2023)의 유전체 7.6만 명도 이 QC를 그대로 썼습니다21. All of Us(245,388명)도 이 방식을 따랐고, 오염·심도·지문 일치를 출고 전 기준으로 뒀습니다22. 기준값은 자기 데이터 분포에서 이상치를 찾는 용도로 쓰는 편이 안전합니다.

⚠️ 한계와 주의

  • 벤치마크 시료가 적고 치우쳐 있습니다. GIAB 주력 시료는 유럽·Ashkenazi·동아시아 계열 몇 명이고, 세포주 DNA라 실제 혈액·조직 시료의 품질 문제를 반영하지 못합니다.
  • 벤치마크 밖은 채점되지 않습니다. v4.2.1도 상염색체의 약 8%는 제외합니다. 새 HG002 벤치마크는 범위를 크게 넓혔지만, 쓰기 전에 README의 사용 조건을 확인해야 합니다. “F1 99.9%“는 벤치마크 영역 안의 숫자입니다.
  • 회사 관련 연구: DRAGEN 성능 논문은 제조사 공동 연구이고13, hap.py 벤치마킹 논문도 Illumina 소속 저자가 여럿 참여했습니다18. SV 비교 논문 일부 저자도 분석 회사 소속입니다16. 챌린지 결과는 2020년 시점입니다.
  • germline 전용: 체세포 변이, 저빈도 모자이크, cfDNA 분석에는 다른 호출기와 기준이 필요합니다(진단 기초 시리즈 17편).
  • 변이 해석은 별개입니다. 정확한 VCF가 곧 정확한 진단은 아닙니다. 병원성 분류는 진단 기초 시리즈 19편에서, 검사 범위(WGS·WES·패널) 선택은 4편에서 다룹니다.

🏛️ 지금 어디까지 왔나

  • FE 표준(2018): CCDG·TOPMed 센터가 합의한 GRCh38·BWA-MEM·CRAM 기반 처리 표준입니다. gnomAD·TOPMed 같은 대형 자료와 비교하려면 이 표준을 따르라고 권합니다. 파일 크기도 30× WGS 기준 54 GB에서 17 GB로 줄었습니다1.
  • GA4GH·GIAB: 벤치마킹 방법(hap.py), 벤치마크 v4.2.1, GRCh37·GRCh38·CHM13용 stratification이 공개돼 있습니다18177. NIST는 HG002에 한해 T2T-HG002 v1.1 기반 v5.0q 벤치마크를 공개해(논문 준비 중) v4.2.1을 대체했습니다. 다른 6개 시료는 v4.2.1을 씁니다25. DNA는 NIST 표준물질(RM 8391·8392)로 구할 수 있습니다14.
  • 임상 검사실: AMP가 CAP·AMIA와 함께 NGS 생물정보 파이프라인 검증에 관한 17개 권고를 냈습니다(2018)26.
  • 한국: 한국인 참조 유전체 KOREF는 2022년 롱리드로 염색체 수준 조립(KOREF_S1v2.1)까지 갱신됐고27, 한국인 4,157명 WGS(Korea4K)도 공개됐지만(두 연구 모두 Clinomics 소속 공저자 포함)28 표준 정렬 참조로 쓰이지는 않습니다. 국내 학회·기관 차원의 WGS 2차 분석 파이프라인 표준이나 QC 공통 기준은 확인하지 못했습니다.

🧪 연구자 노트 (작성자 직접 작성) ① 참조 유전체는 비교할 기존 데이터와 공개 데이터베이스가 무엇을 쓰는지가 가장 크게 작용했습니다. 호출기는 GIAB 시료로 직접 돌려 본 정확도와, 연구실에서 계속 유지할 수 있는지를 함께 봤습니다. ② 시료 뒤바뀜은 성별 확인과 지문 SNP 비교에서, 오염은 FREEMIX 값에서 잡히는 경우가 많습니다. 다른 지표가 정상이어도 이 두 가지는 꼭 확인합니다. ③ GIAB 점수는 고신뢰 영역 기준이라 실제 시료의 어려운 영역에서는 체감 정확도가 더 낮습니다. 그래서 중요한 변이는 다른 방법(Sanger, 긴 리드 등)으로 한 번 더 확인합니다.

🙋 그래서 나에게는? — 분석 전 체크리스트

  • 참조 유전체 판본(파일 이름까지)과 alt·decoy 포함 여부를 정하고, 정렬기가 alt-aware인지 확인했다
  • 비교할 공개 코호트가 있으면 그쪽 처리 표준(FE 등)과 맞췄다
  • 호출기에 맞춰 BQSR 포함 여부를 정했다 (DeepVariant는 생략)
  • 같은 조건으로 시퀀싱한 GIAB 시료(HG002 등)를 함께 돌려 hap.py로 SNV·indel별 precision·recall을 냈다
  • 결과를 전체와 어려운 영역(stratification)으로 나눠 기록했다
  • 벤치마크 판(v5.0q / v4.2.1 등)을 기록했다
  • 시료마다 매핑률·중복률·insert size·Ti/Tv·FREEMIX·성별·친족 관계를 표로 남기고 이상치를 확인했다
  • 도구 버전, 파라미터, 참조 파일 체크섬을 워크플로(Nextflow·WDL 등)와 함께 보관한다

⚠️ 이 글은 의학적 조언이 아니며, 특정 제품을 권하지 않습니다. 실제 조건은 사용하는 장비·키트 설명서와 기관 SOP, 자체 검증 결과를 우선하세요.

❓ 자주 묻는 질문

Q. 이미 GRCh37로 처리한 데이터가 있는데, 다시 정렬해야 하나요? A. 다른 데이터와 합쳐 분석하거나 GRCh38 기반 자원과 비교한다면 FASTQ부터 다시 정렬하는 편이 안전합니다. 판본 차이는 조화 전 파이프라인 간 불일치의 주요 원인이었습니다.

Q. 시료가 몇 개뿐인데 VQSR을 써도 되나요? A. VQSR은 많은 변이로 필터 모델을 학습합니다. GATK 문서는 사람 데이터에서 전장 유전체 1개 이상 또는 엑솜 30개 이상이면 대체로 작동하고, 그보다 작으면 특히 indel 보정이 어렵다고 안내합니다11. 엑솜 몇 개처럼 작은 규모라면 하드 필터나 DeepVariant처럼 미리 학습된 모델로 시료마다 따로 호출하는 도구를 고려하고, GIAB 시료로 결과를 확인하세요.

Q. GIAB에서 F1이 높게 나오면 내 시료도 정확한가요? A. 꼭 그렇지는 않습니다. GIAB는 고품질 세포주 DNA이고 어려운 영역 일부가 빠져 있으므로, 실제 시료 QC 지표와 영역별 결과를 함께 봐야 합니다.

📚 오믹스 기술 시리즈

참고

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  2. Barbitoff YA 외. Systematic benchmark of state-of-the-art variant calling pipelines identifies major factors affecting accuracy of coding sequence variant discovery. BMC Genomics 2022;23:155. doi:10.1186/s12864-022-08365-3 ↩︎

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  5. Nurk S 외. The complete sequence of a human genome. Science 2022;376:44-53. doi:10.1126/science.abj6987 ↩︎

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  9. Vasimuddin M 외. Efficient architecture-aware acceleration of BWA-MEM for multicore systems. IEEE IPDPS 2019:314-24. doi:10.1109/IPDPS.2019.00041; 속도 수치는 bwa-mem2 README(동일 정렬, 약 1.3~3.1배) — github.com/bwa-mem2/bwa-mem2 ↩︎

  10. Google. DeepVariant details (r1.9, 입력 BAM 전처리 권고) — github.com/google/deepvariant ↩︎ ↩︎

  11. Broad Institute GATK. Variant Quality Score Recalibration (VQSR) (2024-06-25 갱신, 2026-11-03 확인) — gatk.broadinstitute.org ↩︎ ↩︎

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  13. Behera S 외. Comprehensive genome analysis and variant detection at scale using DRAGEN. Nat Biotechnol 2025;43:1177-91 (Illumina 공동 연구). doi:10.1038/s41587-024-02382-1 ↩︎ ↩︎

  14. Olson ND 외. PrecisionFDA Truth Challenge V2: calling variants from short and long reads in difficult-to-map regions. Cell Genom 2022;2:100129. doi:10.1016/j.xgen.2022.100129 ↩︎ ↩︎ ↩︎

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  16. Nardone GG 외. A hitchhiker guide to structural variant calling: a comprehensive benchmark through different sequencing technologies. Biomedicines 2025;13:1949 (일부 저자 enGenome 소속). doi:10.3390/biomedicines13081949 ↩︎ ↩︎

  17. Wagner J 외. Benchmarking challenging small variants with linked and long reads. Cell Genom 2022;2:100128. doi:10.1016/j.xgen.2022.100128 ↩︎ ↩︎

  18. Krusche P 외. Best practices for benchmarking germline small-variant calls in human genomes. Nat Biotechnol 2019;37:555-60 (Illumina 소속 저자 포함). doi:10.1038/s41587-019-0054-x ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  19. Marshall CR 외. Best practices for the analytical validation of clinical whole-genome sequencing intended for the diagnosis of germline disease. NPJ Genom Med 2020;5:47. doi:10.1038/s41525-020-00154-9 ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  20. Xiao W 외. Toward best practice in cancer mutation detection with whole-genome and whole-exome sequencing. Nat Biotechnol 2021;39:1141-50. doi:10.1038/s41587-021-00994-5 ↩︎

  21. gnomAD. gnomAD v3.1 new content, methods, annotations, and data availability (2020-10; v4.0 안내 2023-11에서 유전체 QC 유지 확인) — gnomad.broadinstitute.org ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  22. All of Us Research Program Genomics Investigators. Genomic data in the All of Us Research Program. Nature 2024;627:340-6. doi:10.1038/s41586-023-06957-x ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎ ↩︎

  23. Zhang F 외. Ancestry-agnostic estimation of DNA sample contamination from sequence reads. Genome Res 2020;30:185-94. doi:10.1101/gr.246934.118 ↩︎

  24. Pedersen BS 외. Somalier: rapid relatedness estimation for cancer and germline studies using efficient genome sketches. Genome Med 2020;12:62. doi:10.1186/s13073-020-00761-2 ↩︎

  25. NIST. Genome in a Bottle (HG002 v5.0q 안내, 2026-11-03 접속) — nist.gov ↩︎

  26. Roy S 외. Standards and guidelines for validating next-generation sequencing bioinformatics pipelines. J Mol Diagn 2018;20:4-27. doi:10.1016/j.jmoldx.2017.11.003 ↩︎

  27. Kim HS 외. KOREF_S1: phased, parental trio-binned Korean reference genome using long reads and Hi-C sequencing methods. GigaScience 2022;11:giac022. doi:10.1093/gigascience/giac022 ↩︎

  28. Jeon S 외. Korea4K: whole genome sequences of 4,157 Koreans with 107 phenotypes derived from extensive health check-ups. GigaScience 2024;13:giae014. doi:10.1093/gigascience/giae014 ↩︎

#유전체분석#바이오인포매틱스#분자진단#WGS#GIAB

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